靶向胞内癌蛋白的CAR T
CAR T细胞肿瘤免疫疗法在白血病等血液瘤中已展示强大的抗肿瘤疗效，但由于缺乏肿瘤特异性靶点，使其在实体瘤领域的应用受到限制。大多数致癌驱动基因是细胞内蛋白或细胞核内蛋白，免疫系统只有通过主要组织相容性复合体(MHC)递呈的抗原肽才能识别，这就限制了靶向个体人类白细胞抗原(HLA)同种异型呈递的突变肽(新生抗原)的免疫疗法。最新一项发表在《Nature》杂志上的新研究“Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs”，直接让CAR T细胞通过MHC I呈递的未突变且必需的蛋白的肽段靶向肿瘤细胞，部分相关研究内容如下所述。
图2 差异性抗原肽的发现并确定PHOX2B作为免疫治疗靶点
图3 特异性结合pMHC的CAR scFv的筛选
图4 PC-CAR T（10LH与302LH）强效特异性的肿瘤杀伤作用
图5 PC-CAR T（10LH与302LH）强效清除动物模型中神经母细胞瘤
图1 文献信息
宾夕法尼亚大学医学院John M. Maris以及纽约大学医学院Mark Yarmarkovich等的研究人员首先通过进行MHC捕获、肽洗脱和液相色谱与串联质谱法，使用质谱分析神经母细胞瘤(8种神经母细胞瘤细胞来源的异种移植物和患者来源的异种移植物)，随后通过MHC I呈递的免疫多肽组并结合比对正常组织细胞潜在呈递的免疫多肽组，筛选肿瘤特异呈递的多肽，最终确定了差异抗原肽PHOX2B。PHOX2B只在肿瘤组织表达，正常组织随发育不再表达，因此将其作为免疫治疗靶点（图2）。
图2 差异性抗原肽的发现并确定PHOX2B作为免疫治疗靶点
由于自身抗原缺乏免疫原性，在多次筛选中未发现高亲和力TCR后，研究人员选择开发基于scFv的CAR，即以多肽为中心的CAR（peptide-centric chimeric antigen receptors，PC-CARs)。首先通过流式细胞术选择能与pMHC结合的scFvs，并对表现出明显选择性的克隆进行进一步测试，最终筛选出两种与抗原肽特异性结合最强的scFvs：10LH和302LH（图3），进而开发以多肽为中心的CAR T细胞（peptide-centric chimeric antigen receptors T cell，PC-CAR T）。
图3 特异性结合pMHC的CAR scFv的筛选
研究人员在体内和体外实验中展示了PC-CAR T强有力的肿瘤特异性杀伤能力。研究人员先在神经母细胞瘤细胞系（SKNAS、NBSD 和 SKNFI）测试了PC-CAR T的强效特异性杀伤作用（图4），并在三种不表达PHOX2B的细胞系（SW620，结直肠腺癌细胞系；KATO III，胃腺癌细胞系；和HEPG2，肝细胞癌细胞系）中测试了PC-CAR T与脱靶组织呈递的肽环境的功能交叉反应性（图3），结果显示PC-CAR T细胞能选择性消除肿瘤而不靶向和杀伤PHOX2B阴性的细胞系。
图4 PC-CAR T（10LH与302LH）强效特异性的肿瘤杀伤作用
同时，研究人员还使用PC-CAR T治疗移植有神经母细胞瘤异体移植物肿瘤的小鼠，结果发现肿瘤被完全清除，达到治疗终点（图5）；且与使用未处理的CAR T细胞治疗的终点肿瘤相比，PC-CAR T细胞浸润和MHC表达的显著上调，这表明该疗法可以在低抗原密度下激活T细胞扩增，启动前馈级联反应，从而增加MHC和抗原呈递。
图5 PC-CAR T（10LH与302LH）强效清除动物模型中神经母细胞瘤
这些数据表明，PC-CARs有可能扩大免疫治疗靶点的范围，其重点和难点在于寻找抗原肽和筛选特异性结合的scFv。此策略将囊括非免疫原性细胞内的肿瘤蛋白，并可以在临床环境中通过靶向更多的HLA异型进行治疗。与TCR相比，PC-CARs在靶向MHC递呈抗原肽方面具有几个明显的优势：PC-CARs可以通过使用合成的PC受体诱导免疫原性来靶向必需的未突变的癌蛋白，这为通过多种HLA实现更高程度的肽特异性和靶向性开辟了可能性；此外，与靶向膜蛋白的CAR相比，PC-CARs还可能具有启动MHC上调和抗原密度增加的前馈级联反应的能力。
本研究介绍的方法将有助于在其他癌种中发现特异性靶点，并预期构建一个基于scFv的合成免疫疗法文库，为新抗原和自身抗原提供更广泛的HLA基因型覆盖人群，有望扩大CAR T等细胞免疫疗法的应用范围。
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